ELISA相关问题

1. Q：竞争ELISA、双抗夹心ELISA、间接ELISA

A：竞争ELISA：

特点：包被抗体，标记抗原，样本中的抗原与酶标抗原竞争与固体抗体结合，标本中抗原量含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，最后的显色也越浅。

缺点：整体的敏感性和专一性都较差。

用途：小分子抗原或者半抗原的定量检测，当抗原材料中干扰物质不易去除或不易得到足够的纯化抗原时，多用于此方法检测；一般小分子激素及药物常用此法测定。

双抗夹心ELISA：

特点：使用两个特异性单抗或者1个特异性单抗和1个特异性多抗，固相载体包被抗体，酶标记特异性抗体作为检测抗体。

优点：使用两个特异性抗体检测，特异性好。

缺点：成本高。

用途：用于抗原的定量检测。

间接ELISA：

特点：固相载体包被抗原，酶标记二抗，主要用于测抗体。

优点：使用酶标二抗增加了灵敏度，灵活度大，成本低。

缺点：交叉反应几率升高。

用途：通过检测血清中的抗体来检测病毒，如第1，2代艾滋病诊断试剂。最常用于免疫动物血清中抗体含量的测定。

2. Q：为什么推荐双波长检测（450nm和630nm）。

A：ELISA实验终止后形成的是黄色物质，该物质需要在450nm处测定其吸光度，630nm的吸光度只是检测板子本身的吸光度，与酶标板的材质有关，测OD630可以消除各个板孔不干净等非特异性因素引起的误差。如果所使用的酶标仪不可以检测OD630也没有关系，只读取OD450的结果也可以。

数据处理时所用的矫正值，是把所有孔的OD值减去标准曲线0浓度孔的OD值，进一步计算结果。

3. Q：CV值指的是什么 ？

A：CV值是统计学中的一个概念，中文是变异系数，可以认为变异系数和极差、标准差和方差一样，都是反映数据离散程度的绝对值。CV值越小，说明数据的波动程度越小。在描述板内、板间实验结果是否一致时常用到CV值，其越小，说明批内及批间差越小，试剂盒质量越好。

4. Q：标曲拟合方式。

A：ELISA数据处理中所谓的“标准曲线”其实称为拟合曲线比较合适。标准曲线的拟合方式有多种，直线、二次曲线、三次曲线、指数、对数等虽都可用于ELISA及其它生物学反应中的曲线拟合，但都只适用于曲线的一部分，有的适用于前半段，有的适用于后半段，有的适用于中间一段，而四参数Logistic曲线拟合则对曲线的全部都有较好的适用性。目前国际上最流行的免疫检测拟合方式是“四参数Logistic拟合"，用这种拟合方式往往能够比较精确的反映浓度和吸光度的曲线关系，从而进一步比较正确地获得样品中待测物质的浓度值。

建议用专门的软件进行数据处理，这样可以快速、准确地计算出结果。

5. Q：明确标明种属的试剂盒可以用来检测其他种属的样本么？

A：ELISA试剂盒严格区分种属，一般不推荐跨种属检测，不同种属的同一个指标同源性相差可能会很大，抗体的特异性要求比较高，不同种属样本与抗体结合能力会有很大差别。

6. Q：ELISA试剂盒只能检测血清、血清、细胞上清液么？

A：通常我们可用于ELISA检测的样本是有多种类型的，可以是血清、血浆、细胞上清等常规样品，也可以是尿液、细组织匀浆液、细胞裂解液等，不同类型的检测样本前期的处理方法是不一样的。样品中含有影响生物活性的物质会影响检测结果。

7. Q：试剂盒中的酶标板是包被好的么？

A：剂盒中提供的包被板已经包被过检测抗体，可以直接使用。进行ELISA实验时仅限使用本试剂盒中的组分，不能使用别的板条进行实验。96孔酶标板是可拆的，每条8孔。可以根据自己的实验取出部分板条使用，剩余的酶标板放回含有干燥剂的铝箔袋中，4度保存，不会影响酶标板性能。若拆封的酶标板没有正确储存，导致板子受潮，可能会影响检测结果。用过的板条不可重复使用。

8. Q：试剂盒在使用前要室温放置30min ，目的是什么？

A：ELISA试剂盒对于温度的要求比较严格，温度是ELISA结合反应的重要影响因素，这样做主要是为了使试剂温度一致，在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。

9. Q：试剂盒保存温度是多少度？为什么说明书上写的标准品是-20度，标签上写的是4度呢？

A：试剂盒保存温度是4度，说明书中只有标准品标注的保存温度是-20度，由于标准品是冻干的重组蛋白，-20度保存会延长重组蛋白的保存期限。试剂盒的有效期是6个月，冻干的重组蛋白能够在4度保存6个月，但是如果有条件或者想更长时间保存，还是建议能够将标准品-20度保存。

10. Q：样本收集后不能及时检测低温保存可以放多久？

A：样本收集后24之内进行检测，放在4度冰箱即可。如果样本收集后不能立即检测，需将样本置于低温冰箱中，样本3个月内检测可于-20度保存，若存放时间更久，需要用-80度冰箱保存。

11. Q：样品反复冻融影响大么？

A：样品反复冻融对蛋白影响非常大，能导致蛋白降解，非常不建议反复冻融样品。一般蛋白含量丰富的样本例如血清/血浆反复冻融1-2次，对于检测结果影响不是非常大，但是其他类型的样本，例如细胞上清液、肺泡灌洗液，反复冻融会使蛋白降解严重，对检测结果影响非常大。

12. Q：生物素化抗体和酶结合物，稀释后没用完，还可以再用吗？

A：稀释后的生物素化抗体和酶结合物建议在当天用完，放置时间太长可能会影响其活性。可根据自己实验所需用量进行配制，不建议过量配制。

13. Q：变异系数（CV）较大的原因？

A：

14. Q：标准曲线较差？

A：

15. Q：高背景或阴性对照值偏高

A：

16. Q：显色信号弱

A：

17. Q：无显色信号

A：

18. Q：标曲佳但样品孔无信号

A：