抗体相关问题

1. Q：多克隆抗体和单克隆抗体的区别

A：多抗是多个B细胞克隆产生的针对多种抗原表位的多种抗体混合物。

单克隆是一个B细胞克隆产生的针对一种抗原表位的单一抗体。

2. Q：多克隆抗体较单克隆抗体的优势是什么？

A：a)多克隆抗体可有助于放大低表达水平的靶蛋白信号，因为靶蛋白可在多个表位上结合不止一个抗体分子。但是这会给定量实验造成不利影响，因为结果将变得不准确。

b)能识别多个表位，可在IP/ChIP实验中得到更好的结果。

c)能够识别出与免疫原蛋白质具有高同源性的蛋白质，或者从非免疫原物种的组织样品中筛选靶蛋白，例如当未测试物种中的抗原性质未知时，有时会使用多克隆抗体。

d)可识别多个结构域，即使原始抗原的一些空间结构或者序列发生小的变化或者部分抗原决定簇稍微变化时，仍有可能识别抗原。通常多抗是检测变性蛋白的首选。

3. Q：多克隆抗体较单克隆抗体的劣势是什么？

A：a)容易产生批次间差异。

b)产生非特异性抗体，有可能在某些应用中产生背景信号。

4. Q：单克隆抗体和多克隆抗体抗如何选择？

A：对抗体的特异性要求高，用量较大或者需要长期使用一致的抗体。制备的抗体应用要求多，一般选择单抗。对抗体的特异性要求不高，需要做沉淀和凝集反应的检测性实验或者只需做ELISA检测，一般选择多抗。

5. Q：什么是磷酸化抗体？

A：磷酸化抗体：免疫原经过磷酸化，用其制备的抗体就称之为磷酸化抗体。

磷酸化抗体检测蛋白的磷酸化水平如何，侧重于了解该蛋白的一种活性状态。

6. Q：磷酸化抗体与非磷酸化抗体的区别

A：①磷酸化抗体主要是针对磷酸化的抗原制备的，检测该蛋白磷酸化的变化情况（增强还是减弱）。

②非磷酸化抗体主要检测组织或细胞中该蛋白的表达情况、组织分布或细胞中定位，同时可以作为磷酸化水平变化的内参。

③磷酸化抗体检测的是处于磷酸化的蛋白，并且只针对磷酸化位点设计，是一种位点特异性的抗体。

④磷酸化的蛋白很大部分是转录相关因子。因此使用磷酸化抗体和普通抗体 

检测同一个蛋白，原位检测可能具有不同的细胞定位。转录因子磷酸化后由细胞质进入细胞核。

7. Q：注意区分交叉反应和宿主

A：抗体标明的交叉反应也是反应种属，即这个抗体可以检测样本的种属，例如一个一抗的交叉反应是Human Mouse Rat，则这个抗体可以用来检测人和大小鼠的样本。

宿主是指产生这个抗体的种属，即抗体来源，选择二抗时需要注意抗体来源。

8. Q：如何正确选择一抗？

A：a)确定自己实验所用样本的种属，如Human、Mouse、Rat、Pig、Goat等。应选择物种相同或有交叉反应的抗体。

b)确定自己的实验类型，如WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等，一般抗体说明书或者官网信息中会列出该抗体适用于何种分析类型，选择和自己应用匹配的抗体。

c)分析了解样本蛋白的结构性质，抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。

9. Q：根据一抗如何选择二抗？

A：a)确定一抗的来源物种，二抗的反应物种与一抗的来源种属相同即可。例如一抗为鼠源抗体，二抗选择X-鼠（羊抗鼠，兔抗鼠）。

b)除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需与一抗的类别或亚类相匹配，对于多克隆抗体一般多是IgG类型，二抗可以选择X-鼠IgG（羊抗鼠IgG，兔抗鼠IgG）抗体。而单克隆抗体则相对复杂些，由于单克隆抗体有不同的类别和亚型，因此相应的二抗也需要根据这些亚型进行选择。

c)二抗的偶连标记：一般来讲，二抗的偶连标记物常为辣根过氧化酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）、荧光基团（FITC，APC，PE）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于western blot，IHC和ELISA，常用的二抗是酶标二抗，而免疫荧光、流式细胞术中通常使用荧光基团标记的二抗。

d)选择哪种形式的二抗：

整个IgG分子：此种抗体适用于多数情况。 
Fab片段：它们只有一个结合位点，一般用来封闭内源性免疫球蛋白。 
F(ab')2片段：该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成，这些抗体用在特定的情况中，如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况。

10. Q：如何确定抗体的稀释浓度？

A：一般抗体说明书中有推荐的稀释比例，按照推荐的稀释比进行实验即可。但是由于标本类型、实验条件、操作环境等各种因素的影响，推荐浓度仅作为参考。

实验者需要在推荐浓度周围进行多个浓度梯度的实验，从中发现最佳的稀释比例。如果说明书没有推荐稀释比例，则需要做大量的预实验来摸索最佳的稀释比例。

11. Q：如何选择阳性对照？

A：a)大部分抗体说明书中都会提供检测图片，检测图片上的的样本可以作为阳性对照。

b)。根据提供的蛋白SWISS号，到Uniprot网站上查找，网站上一般会列出表达该蛋白的组织。

c)到The Human Protein Atlas网站上查找，在网站上可查到该蛋白在人源的组织和细胞中的表达情况。

d)查找文献，参考文献中表达该蛋白的细胞或组织。

12. Q：抗体能否用于明确标明之外的其他种属或者应用？

A：一般某个抗体明确标注的交叉反应和应用都是经过验证的。其他的种属和应用不确定是否好用。

对于没有验证过的种属，您可以比对一下该抗体的抗原序列和您要检测蛋白的序列的同源性，如果同源性超过85%，则该抗体检测到您目的蛋白的可能性比较高，但是即使很高，也不保证一定能成功检测到。

13. Q：抗体如何保存？

A：抗体在运输过程中要低温运输，收到抗体后存放在-20℃或-80℃。最好避免反复冻融，可分装保存，装可以最大限度减少冻融对抗体造成的损坏。但是每份不建议少于10 uL。因为分装的体积越小，抗体的浓度受蒸发和管壁吸附的影响就会越大。